Der im Todestrakt einsitzende Callum Lynch (M. Fassbender) bekommt von der Firma Abstergo Industries das Angebot, im Tausch gegen sein Leben am streng geheimen Animus Projekt teilzunehmen. Hierfür soll er unter Aufsicht der Wissenschaftlerin Dr. Sophia Rikkin (M. Cotillard), die tief in seinem genetischen Code abgelegten Erinnerungen seines Vorfahren Aguilar de Agarorobo (M. Fassbender), der als eines der tödlichsten Mitglieder des Geheimbundes der Assassinen im Spanien des 15. Jahrhunderts gegen die Templer und ihren Anführer Tomás de Torquemada (J. Irons) kämpfte, noch einmal durchleben. Doch Animus erweist sich nicht nur als Spielerei der Wissenschaft, sondern verfolgt vielmehr den Zweck, Wissen über den Aufenthaltsort eines antiken Artefakts zu enthüllen, das den Nachfahren der Templer, angeführt von Sophias Vater Alan Rikkin (J. Irons), eine mächtige Waffe in die Hand geben würde. Allerdings werden bei dem Experiment nicht nur Erinnerungen in Callum freigesetzt, sondern auch die Fähigkeiten der Assassinen, wodurch er selbst zur letzten Waffe des Geheimbundes im Kampf gegen die übermächtigen Templer wird...